CONCEITO
COMO É FEITO O QUEIJO ARTESANAL ?
O queijo é produzido pela coagulação do leite. Isto é realizado, em uma primeira etapa, pela acidificação com uma cultura bacteriana e em seguida, empregando uma enzima, a quimosina (coalho ou substitutos) para transformar o leite em coalhada e soro.
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO LEITE
O leite é uma combinação de diversos elementos sólidos em água. Os elementos sólidos representam aproximadamente 12 a 13% do leite e a água, aproximadamente 87%. Os principais elementos sólidos do leite são lipídios (gordura), carboidratos, proteínas, sais minerais e vitaminas.
Esses elementos, suas distribuições e interações são determinantes para a estrutura, propriedades funcionais e aptidão do leite para processamento. As micelas de caseína e os glóbulos de gordura são responsáveis pela maior parte das características físicas (estrutura e cor) encontradas nos produtos lácteos. Os termos sólidos totais (ST) ou extrato seco total (EST) englobam todos os componentes do leite exceto a água. Por sólidos não-gordurosos (SNG) ou extrato seco desengordurado (ESD) compreendem-se todos os elementos do leite, menos a água e a gordura. Os componentes do leite permanecem em equilíbrio, de modo que a relação entre eles é muito estável.
O conhecimento dessa estabilidade é a base para os testes que são realizados com o objetivo de apontar a ocorrência de problemas que alteram a composição do leite. Uma redução substancial da concentração de lactose ou dos sólidos totais poderia levantar suspeitas de adição fraudulenta de água, após a ordenha. Nesse caso, ocorrem alterações das propriedades físicas do leite, facilmente detectáveis em laboratório.
A composição do leite pode variar de acordo com o estágio de lactação: no colostro, o conteúdo de proteína é maior e o de lactose encontra-se reduzido. Outros fatores que podem interferir na composição do leite são: raça das vacas, alimentação (plano de nutrição e forma física da ração), temperatura ambiente, manejo e intervalo entre as ordenhas, produção de leite e infecção da glândula mamária.
CARBOIDRATOS
O principal carboidrato do leite é a lactose. É produzida pelas células epiteliais da glândula mamária e é a principal fonte de energia dos recém-nascidos. Além da lactose, podem ser encontrados no leite outros carboidratos, como a glicose e a galactose, mas em pequenas quantidades.
A lactose compreende aproximadamente 52% dos sólidos totais do leite desnatado e 70% dos sólidos encontrados no soro do leite. Controla o volume de leite produzido, atraindo a água do sangue para equilibrar a pressão osmótica na glândula mamária.
A quantidade de água do leite e, conseqüentemente, o volume de leite produzido pela vaca, depende da quantidade de lactose secretada na glândula mamária. A concentração de lactose no leite é de aproximadamente 5% (4,7 a 5,2%). É um dos elementos mais estáveis do leite, isto é, menos sujeito a variações.
PROTEÍNAS
As proteínas representam entre 3% e 4% dos sólidos encontrados no leite. A porcentagem de proteína varia, dentre outros fatores, com a raça e é proporcional à quantidade de gordura presente no leite. Isso significa que quanto maior a percentagem de gordura no leite, maior será a de proteína.
Existem vários tipos de proteína no leite. A principal delas é a caseína, que apresenta alta qualidade nutricional e é muito importante na fabricação dos queijos. A caseína é produzida pelas células secretórias da glândula mamária e encontra-se organizada na forma de micelas, que são agrupamentos de várias moléculas de caseína junto com cálcio, fósforo e outros sais. Cerca de 95% da caseína total do leite está nessa forma. As micelas de caseína junto com os glóbulos de gordura são responsáveis por grande parte das propriedades relativas à consistência e à cor dos produtos lácteos.
A caseína não é facilmente alterada pelo calor, permanecendo bastante estável quando o leite é pasteurizado. Entretanto, quando ocorrem mudanças na acidez do leite, há rompimento da estrutura das micelas, o que faz a caseína precipitar e formar coágulos. A gordura e a caseína têm importância fundamental para a manufatura de vários derivados lácteos, sendo que representam a maior concentração de elementos sólidos dos queijos.
GORDURA
A gordura do leite está presente na forma de pequenos glóbulos, suspensos na fase aquosa. Cada glóbulo é envolvido por uma camada formada por um componente da gordura denominado fosfolipídio. Essa camada forma uma membrana que impede a união de todos os glóbulos.
Desse modo, a gordura do leite é mantida na forma de suspensão. A maior parte da gordura do leite é constituída de triglicerídios, que são formados por ácidos graxos ligados ao glicerol. A gordura do leite está presente em forma de pequenos glóbulos em suspensão na água.
A fração de gordura do leite serve de veículo para as vitaminas lipossolúveis (A, D, E, K), colesterol e outras substâncias solúveis em gordura, como os carotenóides (provitamina A), que dão ao leite sua cor amarelo-creme. A concentração de gordura no leite varia geralmente entre 3,5 e 5,3%, em razão de diferenças entre raças, estágio da lactação e de acordo com a alimentação dos animais.
SAIS MINERAIS E VITAMINAS
O leite é uma fonte excelente da maioria dos sais minerais necessários para o desenvolvimento dos indivíduos jovens. O cálcio e o fósforo do leite apresentam alta disponibilidade, em parte porque se encontram associados à caseína.
Por isso, o leite é a melhor fonte de cálcio para o crescimento do esqueleto dos indivíduos jovens e para a manutenção da integridade dos ossos dos adultos. O conteúdo de ferro é baixo. O leite é uma importante fonte de vitaminas, algumas se associam com a gordura (A, D, E e K), enquanto outras se associam com a parte aquosa. Dentre as últimas, estão as do complexo B e a vitamina C.
Mais de dez vitaminas diferentes do complexo B são encontradas no leite. Entretanto, com exceção da vitamina B2 (riboflavina), as outras são encontradas em quantidades pequenas. As vitaminas do complexo B são produzidas no estômago composto (rúmen) dos animais.
O leite é uma fonte importante de vitamina C (ácido ascórbico), mas esta é rapidamente oxidada na presença de cobre em um produto biologicamente inativo.
HISTÓRIA
Os primeiros europeus que produziram queijo foram os gregos, que utilizavam as cabras e as ovelhas. Mais tarde, os romanos começaram a utilizar o queijo, que se tornou muito importante em suas refeições. Além de ser servido nas principais refeições, o queijo era utilizado como alimento para soldados e atletas. Com o crescimento do Império Romano, houve a divulgação do queijo. Mais tarde, com o declínio do Império Romano, o comércio a longa distância diminuiu, o que contribuiu para o desenvolvimento da diversificação de queijos na Europa, pois vários locais desenvolveram sua própria técnica de produção e produto. Devido à importância da Igreja na economia da Europa Ocidental a indústria do queijo ficou sob a liderança de ordens religiosas, onde surgiram queijos importantes que são produzidos até os dias atuais. A maioria desses mosteiros está localizada na França, onde são feitos uns dos melhores queijos do mundo.
No Brasil, provavelmente a produção de queijos tenha acontecido desde a chegada dos primeiros animais leiteiros de interesse doméstico, como vacas, cabras e ovelhas. Entretanto, a construção de uma linha do tempo é quase impossível pela pouca quantidade de referências destas épocas. Em algumas obras raras, como Cultura e Opulencia do Brazil, por suas Drogas e Minas (1711), os três volumes de History of Brazil (1810), Viagem às Nascentes do Rio S. Francisco e pela Provincia de Goyas (1937), Diálogos da Grandeza do Brasil (1956) são feitas algumas menções à produção de queijos no Brasil, desde seus primórdios. Certamente, os autores destes livros vivenciaram situações distintas e, portanto, são comuns análises bastante diferentes. Essa página está sendo construída a partir de uma vasta pesquisa na leitura destas obras, especificamente nos momentos em que a produção de queijos foi tratada. Além disto, outras leituras históricas e informações recebidas pela vivência com produtores de queijo artesanal podem ser consideradas aqui. O propósito é entender as principais técnicas utilizadas, especialmente no que diz respeito à história da cura dos queijos no Brasil. Na história é descrito como sendo o ‘Descobrimento do Brasil’ a chegada da frota comandada por Pedro Álvares Cabral, em 22 de abril de 1500. Certamente a bordo das caravelas portuguesas Pinta, Nina e Santa Maria vieram alguns dos primeiros queijos para o novo continente, como alimento a tripulação. Não existem relatos de que os índios brasileiros produzissem queijos. Talvez este desafio fosse quase impossível a eles, pois não praticavam nenhum tipo de pecuária leiteira, por mais rudimentar que pudesse ser. Também não havia vacas, cabras e ovelhas nativas no território. Os índios viviam da caça, da pesca, do extrativismo e da produção de frutos, raízes e tubérculos. Quando o Brasil foi ‘descoberto’, as técnicas de produção e de cura de queijos já eram praticadas há muitos séculos em outras regiões do mundo.
"Eles não lavram, nem criam, nem há aqui boi, nem vaca, nem cabra, nem ovelha, nem galinha, nem outra nenhuma alimária, que costumada seja ao viver dos homens. Carta de Pero Vaz de Caminha, de 01/05/1500"
A partir do ‘descobrimento’, os interesses dos portugueses na colônia brasileira foram basicamente extrativistas e monocultores, caracterizados nas finalidades dos ciclos econômicos da Cana-de-Açúcar e da Mineração. Não houve interesse no desenvolvimento da manufatura diversificada, inclusive alimentar, no Brasil. A ocupação humana foi basicamente suficiente para a manutenção e gestão dos ciclos econômicos. Era hábito comum o consumo de produtos importados de outros países da Europa, como os queijos. Nos livros apresentados anteriormente há menções à comercialização do queijo do Alem-tejo e de queijo alemão na colônia. Pode-se supor que, inicialmente, a pecuária se desenhou como coadjuvante nos ciclos econômicos da Cana-de-Açúcar e da Mineração no Brasil. Na medida em que as explorações aconteciam juntamente a elas foram instaladas a criação de cabras, ovelhas e, especialmente vacas com fins quase subsistencialistas de produção de alimentos. Porém, com a decadência destes ciclos produtivos, a pecuária assumiu papel de maior importância na geração de renda, ocupação e na produção local de alimentos. Neste aspecto, a produção de queijos ganhou notoriedade no dia-a-dia, especialmente por sua importância na conservação dos nutrientes do leite cru e para estabilizar o produto, permitindo o seu comércio e distribuição pelas inúmeras cidades que surgiam.
Durante o ciclo da Cana-de-Açúcar, iniciado em meados do século XVI no litoral e agreste do nordeste brasileiro, houve imigração de povos para a colônia, especialmente portugueses e africanos trazidos, como escravos de diversas regiões da África. As primeiras vacas foram trazidas por Martim Afonso de Souza e sua esposa Ana Pimentel de Souza, em 1534. Estes animais foram especialmente utilizados para a geração de força motriz nos Engenhos de Trapiche e para o transporte com os carros de boi. Iguarias e alimentos, como queijos, destinados à alimentação do Senhor de Engenho e nobres da época eram trazidos da Europa. A produção local de leite era basicamente subsistente. Não era interesse da administração colonial, durante este ciclo econômico, o desenvolvimento da pecuária. Talvez a principal constatação deste fato tenha sido a publicação da Carta Régia de 1701, pela Coroa Portuguesa, pela qual se proibia a produção de gado em uma faixa de 10 léguas, aproximadamente 48 km, do litoral da costa. Com isto, a criação destes animais foi deslocada, ou empurrada, para o interior. Vacas e bois eram vistos, pelos Senhores de Engenho, como ameaça ao monocultivo da cana-de-açúcar, pois demandavam espaço e invadiam os canaviais para se alimentar.
Na obra Diálogos das Grandezas do Brasil, cuja autoria provavelmente pertence a Ambrósio Fernandes Brandão, Senhor de Engenho e Escritor, que viveu de 1555 a 1618, é possível a leitura de trechos específicos do beneficiamento do leite nas regiões que ambientaram o ciclo da Cana-de-Açúcar, a saber: De vacas leiteiras havia currais, poucos, porque não fabricavam queijos nem manteiga; pouco se consumia carne de vaca, pela dificuldade de criar rezes em lugares impróprios à sua propagação, pelos inconvenientes para a lavoura resultantes de sua propagação, que reduziu este gado ao estritamente necessário serviço agrícola. Tem-se mais no diálogo entre Brandonio e Alviano, desta mesma obra, a saber: Brandonio: A vaca, sendo boa, é estimada nestas capitanias da parte do Norte, em quatro e cinco mil réis, e o novilho, que serve já para se poder meter em carro, a seis e a sete mil reis; e um boi já feito vale doze até treze mil réis. E êste é o prêço mais ordinário. Também se produzem na terra muitas ovelhas, carneiros e cabras, em tanto que das ovelhas parem muitas de um ventre dois carneiros, e das cabras a dois e a três cabritas. Alviano: Isso é coisa estranha; e pois tanto multiplica o gado, de semelhante espécie não deve de carecer a terra de queijos, nem de lã. Brandonio: Antes não há nela nenhuma coisa dessas, porque seus moradores não se querem lançar a isso; que podendo ter grande quantidade de lã de ovelhas, ainda que não fôra mais que para enchimento de colchões, se contentam antes de comprar a que trazem do Reino a três e a quatro mil réis; e da mesma maneira os queijos, E passa esta negligência tanto avante, que, com se dar semelhante gado grandemente na terra, não se querem dispor à cria dêle, contentando-se cada um de criar sòmente o que lhe basta para provimento de sua casa, que não pode ser maior vergonha.
Nos três volumes de History of Brazil, considerada a obra mais extensa sobre Brasil colonial, de autoria do Historiador inglês Robert Southey, que viveu de 1774 a 1843, há uma realidade diferente daquela apresentada por Ambrósio Brandão. Obviamente, Robert Southey viveu em uma época pelo menos 100 anos mais recente que Ambrósio Brandão. Robert Southey relata um contexto produtivo de leite e de queijo mais vigoroso. Há menção à importação de vacas, ovelhas e cabras de Cabo Verde e da Europa, cujos leites eram utilizados para a produção de queijos e manteiga. Um interessante relato é feito no terceiro volume, a respeito de queijos produzidos no sertão de Pernambuco, os quais eram considerados como excelentes quando novos, mas se tornavam duros com o passar de quatro a cinco semanas. Conforme Robert Southey, as habilidades para a produção de lácteos não iam além destas.
A produção do Requeijão do Sertão por escravos africanos e sua constante presença nas feiras também é relatada nestas obras raras.
Provavelmente o queijo a que se referiu Robert Southey seja o antepassado do Queijo de Coalho, cuja produção é antiga e com fortes laços artesanais, regionais e culturais. Mesmo tendo sido o antepassado do Queijo de Coalho o primeiro queijo brasileiro, não seria possível atribuir a sua produção o desenvolvimento das primeiras técnicas de maturação. É possível esta suposição, pois se trata de uma variedade de queijo tipicamente consumida poucos dias após a fabricação.
As etapas básicas para a sua produção, mantidas até os dias atuais, compreendem a coagulação enzimática do leite, enformagem, prensagem, salga e estabilização. Em suas obras o Historiador Robert Southey fez outras rápidas menções a produção de queijos no Brasil colonial. Em 1784 relatou grande produção de queijos no Pará, a qual tratada, porém com qualidade inferior ao queijo do já conhecido Alem-tejo. Relatou que havia algum tipo de produção de leite no extremo Sul do Brasil, mas que o gado tinha comportamento bastante selvagem e pouco leite era transformado, naquela época, em queijo ou manteiga. Relatou a produção de queijo de boa qualidade na região da baia do Paranaguá, Paraná, a partir de vacas, cabras e ovelhas.
Queijo no Pará
A produção de queijos aconteceu de forma mais acentuada durante o Ciclo da Mineração, ambientado na região dos atuais estados de Goiás, Mato Grosso, Bahia e, especialmente, Minas Gerais, a partir do final do século XVII. Durante a exploração do ouro e das pedras preciosas, muitos centros urbanos surgiram, dando origem a cidades como Diamantina, Serro, Ouro Preto, Mariana, Sabará, São João del Rey, Tiradentes e Paraty. Estes centros urbanos receberam muitos imigrantes, vindos de outras regiões do Brasil e também da Europa. Para atender a demanda alimentar das crescentes populações, produzir alimentos in situ foi fundamental.
As dificuldades de rápido escoamento do leite cru das roças para as cidades, especialmente devido ao relevo montanhoso de Minas Gerais, fizeram da produção de queijos a estratégia para conservar os nutrientes do leite cru e também para distribuí-los para o mercado consumidor, no lombo de animais. Com a decadência do Ciclo da Mineração, a pecuária leiteira passou a ser uma das grandes fontes de geração e riqueza para as regiões que ambientaram o extrativismo mineral. A produção destes queijos foi disseminada por diversas regiões, acompanhando o tropeirismo. Os queijos que surgiram a partir do Ciclo da Mineração são basicamente feitos da mesma forma até hoje. São produzidos com o leite cru, utilizando coagulante e o ‘Pingo’, que é um soro-fermento com microrganismos naturais e típicos da propriedade. O uso de prateleiras de madeira para a cura dos queijos também é mantida, como nos primórdios. Ao contrário disto, a utilização de bancas e formas de madeira foi proibida pelo serviço de Inspeção sanitário.
Acredita-se que a cura dos Queijos Minas Artesanal tenha sido empiricamente realizada nas roças, com a finalidade de tornar os queijos mais estáveis para que pudessem ser transportados em balaios e no lombo de animais, sem serem danificados durante o trajeto. Além disto, deve ter sido um procedimento para reunir uma quantidade de queijos para ser transportada. Talvez, comer um queijo fresco e branco fosse privilégio de quem morava na roça. Os queijos vendidos nas vendas das cidades eram mais amarelos, mais firmes e, supondo-se o tempo de cura e o tempo gasto para o transporte, provavelmente tinham sabor e aroma diferenciados, devido ao desenvolvimento e a sucessão dos microrganismos. Ouve-se falar, dos moradores mais antigos, que os queijos eram curados em prateleiras de madeiras nos porões das casas e até em gavetas de móveis de madeira. Alguns produtores costumavam amarrar os queijos em panos para curá-los. Utilizar prateleiras presas ao teto era uma estratégia para evitar o ataque de ratos.
Queijos com aspectos diferentes, como a presença de fungos filamentosos e com a casca ‘molenga’ (queijo Casquinha da Canastra) costumavam ser rejeitados pelos tropeiros que faziam o comércio destes produtos. Alguns utilizavam a expressão ‘queijo doente’ ou ‘queijo com piolho’ para se referir a eles. Estes queijos geralmente eram consumidos na propriedade ou vendidos nas vendas com ‘tira-gosto’, após serem ‘descascados’. Os ‘queijos doentes’ ou ‘queijos com piolho’ provavelmente foram colonizados a cura, seja por fungos filamentosos, por leveduras, por bactérias e até ácaros. Certamente, muitas hidrólises aconteceram e muitos flavours devem ter sido neles experimentados. Em algumas regiões, estas colonizações são chamadas de ‘surgimentos’. Há de se considerar que, naquela época, devido a condições inadequadas de higiene e de estrutura, talvez não fosse possível maturar um queijo por períodos maiores. Entretanto, com os investimentos percebidos na atualidade, maturar queijos por longos períodos é bastante possível e rentável.
Talvez um dos relatos mais detalhados da produção e comercialização do Queijo Minas Artesanal tenha sido aquele feito pelo Botânico e Naturalista Frances Augusto de Saint-Hilaire (1779 – 1853), em sua obra Viagem as Nascentes do Rio S. Francisco e pela Provincia de Goyaz. Saint-Hilaire faz menção a um queijo amarelo, com sabor adocicado e agradável, produzido na região de São João del Rey, Minas Gerais. O Queijo Minas Artesanal recém produzido apresenta sabor basicamente salgado e ácido. O sabor ácido decorre da fermentação da lactose por bactérias láticas, com consequente produção de ácido lático. Alguns dias após, é comum que este sabor ácido seja substituido por um sabor adocicado, devido a atividade de bactérias propiônicas. Somado-se este sabor à existência da casca amarela, o que Saint-Hilaire relatou é um forte indicativo de queijo curado, talvez por um curto período de 15 dias, aproximadamente, hoje sabemos que isso é bem diferente de um queijo maturado, portanto, não confundam queijo curado com queijo maturado.
A maturação de queijos artesanais em Minas perdeu importância, enquanto técnica de conservação, quando as trilhas e estradas de terra deram lugar à rodovias e quando as embalagens e a refrigeração surgiram. Estas mudanças dispensaram a necessidade de se maturar e os queijos se tornaram branco, com sabor basicamente salgado e ácido. Perdeu-se, em parte, o benefício da sucessão microbiana para a produção de flavour. Os microrganismos ‘artistas’ dos queijos perderam o tempo para completar sua obra. Todos as atuais experiencias com a maturação, realizadas nas roças e nas queijarias artesanais, são esforços dos produtores contemporâneos para resgatar a produção de flavour e textura e, até mesmo, para entender o que seus queijos poderiam ser. Vivemos o momento da maturação pela qualidade sensorial e, não apenas, da maturação pela conservação.
A vinda de imigrantes para o Brasil, especialmente para as regiões sul e sudoeste, dentre os séculos XIX e XX, contribuiu para a introdução de variedades e o aprimoramento da produção de queijos no Brasil. Exemplo de queijos que receberam esta valiosa contribuição são o Serrano (Santa Catarina), Colonial (Rio Grande do Sul), Queijo Prato (Minas Gerais), Queijo do Reino (Minas Gerais), Kochkäse (Santa Catarina), muçarela, dentre outros. A primeira fabrica de laticínios do Brasil – Companhia de Laticínios Mantiqueira, foi montada muitos séculos após o primórdio da produção leiteira e de queijos. Ela foi instalada no município mineiro de Palmyra, atualmente Santos Dumont, em 1888, por Carlos Pereira de Sá Fortes, com a contribuição do holandês Albert Boeke e dos Mestres Queijeiros Gaspar Long, João Kingma e J. Etienne. O principal queijo produzido foi o Queijo do Reino, de longa maturação.
Após quase 500 anos da chegada das primeiras fêmeas leiteiras ao Brasil, os produtores de queijo artesanal vivem uma nova fase histórica, basicamente iniciada a partir do ano de 2002 e fortalecida a partir de 2012, no movimento denominado "salve o queijo artesanal". Contemporaneamente, o trabalho de muitos queijeiros, espalhados por todos os cantos do Brasil, destina-se a utilizar a cura não apenas como técnica de conservação ou de preparo para o transporte, mas sim de produção de sabores, aromas e texturas peculiares em seus queijos. Digamos que o momento é de se descobrir qual é o valor e qual é o resultado do trabalho dos microrganismos de cada fermento e esporo. Tudo isto tem sido impulsionado por uma crescente aceitação dos queijos artesanais por segmentos de mercado bastante diferenciados, interessados em novos sabores, aromas e texturas, em terroir, em alimentos artesanais, locais e com conotações históricas e culturais. Há incessante busca por conhecimentos a respeito das condições de maturação mais apropriadas para privilegiar a atividade de microrganismos ‘artistas’ e desprestigiar bactérias indesejadas, ou reações indesejadas.
No sistema monetário colonial 1 oitava de corresponde a 3,585 g de ouro.
Enzimas Lácteas
O setor de lácteos é um tradicional usuário de enzimas.Além da sua utilização na coagulação do leite para fabricação de queijo, a indústria de lácteos também faz uso de enzimas como lipases, proteases não-coagulantes, amino peptidases, lisozima, lactase,e lactoperoxidase.Algumas destas aplicações são tradicionais, como por exemplo, a lipase para realçar o sabor, enquanto outras são relativamente novas, como a hidrólise da lactose para acelerar a maturação dos queijos, controlar a deterioração microbiológica, e alterar a funcionalidade das proteínas. As enzimas foram descobertas no século XIX, aparentemente por Louis Pasteur (1822-1895), que concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura é catalisada por fermentos. Pas- teur postulou que esses fermentos (as enzimas) eram inseparáveis da estrutura das células vivas do levedo, declarando que “a fermentação alcoólica é um ato correlacionado com a vida e organização das células do fermento e não com a sua morte ou putrefação”. Em 1878, Wilhelm Kühne (1837- 1900) empregou pela primeira vez o termo “enzima” para descrever este fer- mento, usando a palavra grega ενζυμον, que significa “levedar”.
O termo passou a ser mais tarde usado apenas para as proteínas com capacidade catalítica, enquanto que o termo “fermento” se referia à atividade exercida por orga- nismos vivos.Em 1897, Eduard Buchner (1860- 1917) descobriu que os extratos de leve- do podiam fermentar o açúcar em álcool e provou que as enzimas envolvidas na fermentação continuavam funcionando mesmo quando removidas das células vivas. Esta descoberta valeu-lhe o Prêmio Nobel de Química em 1907. Restava determinar qual a natureza das enzimas. Alguns afirmavam que as proteínas, associadas à atividade enzimática, apenas eram o suporte da verdadeira enzima e, por si próprias, incapazes de catálise. Em 1926, James Batcheller Sum- ner (1887-1955) purificou e cristalizou a urease, mostrando tratar-se de uma proteína pura, e fez o mesmo, em 1937, para a catalase. A prova final foi feita em 1930, com o estudo de três enzimas digestivas, a pepsina, a tripsina e a quimotripsina. John Burdon Sanderson Haldane (1892- 1964) escreveu um tratado intitulado “Enzimas”, onde continha a notável sugestão de que as interações por ligações fracas, entre a enzima e seu substrato, poderiam ser usadas para distorcer a molécula do substrato e catalisar a reação. A cristalização de enzimas purificadas permitiu que as suas estruturas moleculares pudessem ser examinadas por cristalografia de raios X, o que aconteceu primeiro com a lisozima, uma enzima que existe na saliva, lágrimas e na clara de ovo e destrói a parede celular de bactérias. Começaram assim a bioquímica e biologia estruturais, que se esforçam por compreender o funcionamento das enzimas a nível atômico.
Quimicamente, as enzimas são proteínas com uma estrutura química especial, contendo um centro ativo, denominado apoenzima e, algumas vezes, um grupo não protéico, denominado coenzima. A molécula toda (apoenzima e coenzima) é dado o nome de haloenzima. Dependendo do tipo de ligação, o grupo prostético pode ser separado da proteína por métodos brandos, como por exemplo, a diálise. Em alguns casos, as enzimas podem estar ligadas a moléculas orgânicas de baixo peso molecular, ou íons metálicos, cuja função é ativar as enzimas a eles ligados, denominados cofatores. As enzimas são substâncias sólidas, mas difíceis de serem cristalizadas de- vido à complexidade de suas estruturas químicas. Com algumas exceções, são solúveis em água e álcool diluído e, quando em solução, são precipitadas pela adição de sulfato de amônio, álcool ou ácido tricloroacético. São inativadas pelo calor e esta, talvez, seja a propriedade mais importante desses compostos em relação a tecnologia de alimentos. As enzimas são classificadas em seis principais classes: oxidoredutases, transferases, hidrolases, liases, isomera- ses e ligases.
Cada classe é dividida em subclasses que identificam a enzima em termos mais específicos e que são re- presentadas pelo segundo algarismo. O terceiro algarismo define com exatidão o tipo de atividade enzimática e o quarto é o número da enzima dentro da sua subclasse. As enzimas podem também ser designadas por nomes que obedecem a uma sistemática e são constituídos de duas partes: uma indicando o substrato e a outra indicando a natureza da rea- ção. Como essa nomenclatura também é complexa, as enzimas são geralmente identificadas por nomes triviais, já em uso há muito tempo. As reações químicas que se processam no organismo são de diferentes tipos e necessitam de catalisadores diferentes. Essas reações são catalisadas por enzimas diferentes, fato que serviu de base à classificação das enzimas, agrupando enzimas que catalisam as mesmas reações em uma mesma classe.As enzimas são extremamente eficientes. Nos processos industriais, a ação específica das enzimas permite obter altos rendimentos com um mínimo de subprodutos indesejáveis. Uma molécula de enzima pode cata- lisar a transformação de muitas molécu- las do substrato, por exemplo, a enzima catalase, encontrada abundantemente no fígado, é tão eficiente, que em um minuto uma molécula desta enzima pode catalisar a separação de cinco milhões de moléculas de peróxido de hidrogênio, em água e oxigênio. Ao contrário da maior parte dos catalisadores inorgânicos, as enzimas trabalham em condições físicas e quí- micas apropriadas de pH, temperatura, tempo, concentrações de substrato, enzimas e cofatores; presença ou ausên- cia de íons ativadores ou inibidores. A eficácia de cada enzima depende de ter suas condições ideais respeitadas dentro de certos limites, senão serão ineficazes ou serão destruídos reversível ou irrever- sivelmente.
Muitas enzimas funcionam otimamente a uma temperatura de 30°C a 40°C e em ambientes com pH neutro (pH=7). Para certas aplicações foram desenvolvidas enzimas que aceitam temperaturas de trabalho mais elevadas, lembrando que a maioria das enzimas são desnaturadas sob temperaturas acima de 100oC. É por este motivo, que se costuma dizer que os processos enzimáticos são economizadores potenciais de energia e que eles também poupam investimentos em equipamentos especiais, resistentes a altas temperaturas, pressão ou corrosão. As enzimas podem ser de origem animal, vegetal e bacteriano, podendo ser produzidas, utilizando-se de técnicas simples ou associadas - de homogeneização e centrifugação diferenciada; de extração e precipitação fracionada; de maceração e precipita- ção; de exsudação, filtração e secagem; de produção de crescimento bacteriano; de fermentação, etc. Por exemplo, numa produção de enzimas para fins comerciais, usando a fermentação industrial, as condições são totalmente assépticas, o “caldo” de fermentação é super aquecido para formar um meio de nutrientes completamente estéril, que será convertido nas enzimas desejadas pela ação de microorganismos selecionados, na presença de oxigênio.
Os microorganismos são bactérias, fungos ou leveduras, que podem conter cada um, mais de 1.000 enzimas diferentes. Por este motivo é necessário um longo período de estudos em laboratório, para isolar e selecionar o melhor micro- organismo capaz de produzir a enzima desejada com altos rendimentos. A escolha do “caldo” do micro- organismo e das condições operacionais determinarão o tipo e o rendimento da enzima. Aplicam-se processos de centrifugação, filtração e precipitação para separar as enzimas e remover outras partículas sólidas do caldo de fermentação. A biomassa resultante da filtração contém os resíduos de microorganismos e matérias-primas, formando um composto que, às vezes, como já foi mencionado, pode ser um ótimo fertilizante natural. O ciclo completo de produção, entre esterilização, fermentação e extração, leva de 2a10 dias.
As principais enzimas utilizadas em produtos lácteos são apresentadas na Tabela 1.
A preparação enzimática mais conhe- cida utilizada pelo setor lácteo é o coalho, nome coletivo dado às prepa- rações comerciais contendo proteases ácidas extraídas de tecidos animais. De fato, a produção de queijo com o uso de enzimas exógenas data de 6000 a.C. O coalho natural, chamado renina, é uma enzima proteolítica secretada pela mucosa gástrica do estômago dos bezerros antes do desmame. Esta secreção é produzida na forma de um precursor inativo, a pró-renina, que em meio neutro não tem atividade enzimática, mas em meio ácido transforma-se rapidamente em renina ativa.
O coalho possui duas enzimas: a quimosina e a pepsina. A primeira é o componente principal a qual, após o desmame, tem sua produção reduzida, passando a pepsina a ser o componente majoritário. A atividade proteolítica do coalho é exercida principalmente sobre a caseína e em menor grau sobre as outras proteínas. Realiza duas ações fundamentais: A primeira ação do coalho é provocar a desestabilização das micelas de caseína, rompendo a κ-caseína em um ponto determinado de sua molécula: o enlace peptídico entre o aminoácido fenilalanina e seu vizinho, a metionina. Geralmente a força do coalho é medida através da eficácia ao romper as ligações peptídicas, ação que produz a coagulação do leite. Na caseína kappa existem 164 ligações peptídicas que podem ser atacadas, além de outras que existem nas outras frações da micela.
O segundo papel do coalho é de hidrolisar essas ligações segundo uma ordem específica, que é característica da enzima utilizada. Esta ação secundária sobre as proteínas começa lentamente depois da coagulação e continua durante a maturação do queijo. Os coalhos comerciais estão pre- parados para ter uma determinada capacidade coagulante denominada “força”. Expressa-se como a relação entre o volume de leite coagulado por unidade de volume de coalho, em condições determinadas. Assim, as unidades Soxhlet indicam o no de litros de leite coagulado por um litro de coalho em 40 minutos (2.400 segundos) a 35oC. A equação abaixo é utilizada para calcular a força do coalho:
F = 2400 x V / T x v
Nesta equação, F é a força do coalho, V o volume de leite, T o tempo de coagulação em segundos e v, o volume de coalho. Um dos diversos fatores que influenciam a coagulação enzimática é a dose de coalho utilizada. Nas mesmas condições, a quantidade de coalho adicionado influencia proporcionalmente a velocidade de coagulação e as propriedades reológicas (firmeza) da coalhada. A temperatura também exerce um papel importante na coagulação. As condições ótimas para a ação do coalho são entre 40oC e 42oC, já que em temperaturas inferiores a 10oC e superiores a 65oC, não se produz coagulação. A temperatura influi sobre o fenômeno global da coagulação e afeta de diferentes formas cada uma das fases. A fase primária de ação enzimática sobre a κ-caseína pode ser produzida, inclusive, a temperaturas inferiores a 10oC; já a fase secundária, mais sensível, necessita temperaturas superiores para que se produza a coagulação propriamente dita. O pH influi sobre a velocidade de coagulação e a consistência da coalhada. No meio alcalino, o coalho é inativado e o leite não coagula. Ao contrário, um abaixamento de pH facilita a ação do coalho sobre a caseína, pois a acidez reduz sua carga elétrica, diminuindo a estabilidade da micela. O pH para a ação do coalho é 5,5. Em condições idênticas, a duração média de coagulação é de cerca de 200 segundos a pH 6,6-6,7; 50 segundos a pH 6,1; e 30 segundos a pH 5,7.
A concentração do íon Ca++ também influencia a coagulação. Não intervém na fase enzimática, somente na fase secundária, a da coagulação propriamente dita. Quando o conteúdo de Ca++ é anormalmente baixo, a coagulação é lenta e se obtém uma coalhada branda. Para evitar este defeito adiciona-se CaCl2. O conteúdo de fosfato cálcico coloidal também é importante no processo de coagulação, principalmente no que se refere à tensão do gel. Com o aumento da produção mundial de queijo, a demanda de coalho sofreu um aumento. Ao mesmo tempo, o preço do coalho subiu consideravelmente. Em parte pelo custo crescente para a extração e pela redução de animais lactantes disponíveis. Como consequência desta situação, ocorreu um enorme interesse pelo desenvolvimento e utilização de substitutos para o coalho animal.Os primeiros coagulantes utilizados como substitutos foram uma mistura de renina e pepsina bovina, extraída de animais sacrificados com mais idade ou de terneiros que tiveram alimentação mista. Depois foram empregados preparados à base de coalho de vaca e pepsina porcina, compostos de pepsina bovina pura ou mesclada com pepsina de porco. As comunidades judias utilizam pancreatina e pepsina de frango. Todas estas enzimas de origem animal são instáveis a pH neutro e alcalino e são inativadas pela ação da luz. Também se utilizam enzimas coagulantes extraídas de diversos vegetais, como alcachofra, melões, figos, etc. Os resultados obtidos não são satisfatórios porque a ação proteolítica destas enzimas é muito intensa. Os coalhos de origem microbiana passaram então a ser utilizados cada vez mais como substitutos dos coalhos animais. São preparados extraindo-se as enzimas coagulantes produzidas por alguns microorganismos.
Os melhores resultados são encontrados com os mofos do gênero Mucor, mais especificamente, Mucor miehei. Na prática, independentemente do tipo de coalho utilizado, recomenda- se não diluí-lo até o momento de sua utilização, especialmente o de origem animal, o qual é muito instável a pH neutro ou alcalino. Não deve ser adicionado até a total dissolução do cloreto de cálcio. Deve ser armazenado a frio e em recipiente opaco. Durante sua manipulação deve-se evitar agitação excessiva e formação de espuma. Na coagulação mista é obtida uma coalhada com propriedades intermediárias, com características diferentes das coalhadas obtidas por um único método de coagulação. O percentual de coalho e a acidificação podem variar dependendo do tipo de queijo que se deseja fabricar. Obtém-se coalhadas mistas pela ação do coalho sobre um leite mais ou menos ácido e por acidificação de um gel obtido enzimaticamente. Entre outros efeitos, no primeiro caso, a acidez diminui o tempo de coagulação enzimática e, no segundo, a coalhada enzimática sofre uma progressiva desmineralização.
Enzimas de coagulação do leite, coalhos e coagulantes
A primeira preparação comercial padronizada de coalho foi desenvolvida e comercializada pela Chr. Hansen A /S, na Dinamarca, em 1874, e provavelmente utilizadas na tecnologia de fabricação do queijo, são classificadas como pro- teinases aspárticas pela Comissão de Enzimas (Enzyme Commission - EC) sob o número 3.4.23. Atualmente, como existem no mercado vários tipos e fontes de enzimas de coagulação do leite, a Federação Internacional de Lácteos (International Dairy Federa- tion - IDF) decretou oficialmente que a definição do nome de “coalho” seja reservada para as preparações enzimáticas do estômago de ruminantes, e as outras enzimas de coagulação do leite (principalmente as microbianas) sejam nomeadas “coagulantes”. Na opinião dos tecnólogos, quanto a fabricação do queijo, os coalhos e coagulantes são mais úteis categorizados por sua origem, não apenas para distinguir fontes animais, vegetais, preparações microbianas e OGM, mas também para selecionar a enzima mais adequada para qualquer variedade de queijo especial. Esse é um aspecto muito importante da tecnologia de fabricação do queijo que afeta a produção do queijo, a vida de armazenamento e sua qualidade final, quanto ao sabor/textura após a maturação, a tabela 2 apresenta a relação de coalhos e coagulantes disponíveis no mercado.
Dos coalhos animais, o de bezerro é amplamente considerado como a enzima ideal para coagulação do leite para fabricação de queijo. Essa preferência decorre da tradicional familiaridade com o produto, mas tem também uma base científica sólida de que o coalho de bezerro possui tipicamente 80% a 90% de quimosina (CE 3.4.23.4). Isso significa que a maioria da quebra de caseína no queijo é dirigida muito especificamente à κ-caseína para coagular o leite, e não a outras caseínas. Ovinos, caprinos e suínos podem fornecer preparações de coalho enzimaticamente semelhantes ao coalho de bezerro, mas não ideais para a coagula- ção do leite de vaca. A pasta de coalho é uma forma mais bruta de coalho, feita a partir dos estômagos maceradas do bezerro, cordeiro ou cabrito, que contém lipase pré-gástrica, para adicionar sabor picante ao queijo. É muito usada nos queijos italianos tradicionais.
Muitas plantas produzem proteinases que servem para coagular o leite. No entanto, coagulantes vegetais não são produzidos em escala comercial, mas somente localmente (principalmente em Portugal) para a produção de queijo artesanal.
O coagulante microbiano mais conhecido e mais utilizado é produzido a partir de Rhizomucor miehei (veja Tabela 2). A preparação comercial é uma mistura de aspartil proteinases (CE 3.4.23.23), comercializada em três tipos. A nativa, enzima não modificada (tipo L), é muito estável ao calor e hidrólisa todas as caseínas, e não apenas a κ-caseína. Embora tenha sido usada com sucesso em uma varie- dade de queijos leves, mais suaves, sua ação proteolítica não específica reduz os rendimentos em queijos duros e semi-duros, causando amargor em queijos de longa maturação. A resistência térmica da enzima é também uma potencial desvantagem nas fábricas de queijos, nas quais o soro do leite é processado como ingrediente alimentício.
O tratamento térmico e o processamento não eliminam a atividade do coagulante e podem causar degradação das proteínas em outros produtos alimentícios, onde a proteína de soro de leite é um ingrediente complementar (por exemplo, salsichas, tortas de carne, sopas). Para superar esses problemas, os produtores de enzimas lácteas desenvolveram versões do coagulante R. miehei (TL e XL) que se destroem no calor, utilizando oxidação química para modificar as cadeias laterais de metionina. Essas enzimas podem ser desnaturadas por pasteurização do soro, e são geral- mente menos proteolíticas do que a proteinase nativa.
Esses coagulantes são uma boa alternativa para a quimosina produzida por fermentação utilizada na fabricação de queijos “vegetarianos”, mas a textura do queijo torna-se mais rapidamente quebradiça do que aquela do queijo feito com quimosina natural. Além disso, o perfil de sabor dos queijos de massa dura feitos com coagulante fúngico não é o mesmo do que o do queijo feito com quimosina. A alternativa para o coalho de bezerro mais utilizada na indústria queijeira no mundo inteiro é a quimosina produzi- da por fermentação, FPC (Fermentation- Produced Chymosin). É produzida por fermentação em larga escala de Kluyve- romyces lactis ou Aspergillus Níger, geneticamente modificados. Em ambos os casos, o microorganismo foi modificado geneticamente, com a incorporação do gene da pró-quimosina do bezerro no organismo hospedeiro como um promotor adequado para assegurar a sua secreção eficiente no meio de crescimento. A enzima é relativamente fácil de colher e purificar a partir da cultura, ao contrário do sistema de produção anterior, que utilizava Escherichia coli e a proquimosina era empacotada em corpos de inclusão, solubilizada, isolada, purificada e tratada com ácido para produzir uma quimosina geneticamente ativa.
ENZIMA LACTOPEROXIDASE
A lactoperoxidase é uma enzima que faz parte da família das peroxidases. Foi descoberta no leite, em 1929, quando se constatou que sob certas condições, o leite não se contaminava. Foi identificada e estudada por B. Reiter e K.M. Pruitt (Biochemistry of peroxidase system: antimicrobial effects). A lacto- peroxidase produz principalmente o composto hipotiocianeto, a partir do tiocianato, que está em equilíbrio com a função ácida, HOSCN. O hipotiocianeto é conhecido por ter uma ação sob os grupos SH dos microorganismos. Os principais compostos antimicro- bianos gerados pela lactoperoxidase são compostos conhecidos por serem bacte- ricidas ou bacteriostáticos, dependendo do tipo de bactéria (gram+, Gram-). Os antimicrobianos (OSCN-, OI-) gerados são geralmente viruscidas e fungicos (OI-). Essa enzima não somente tem propriedades antioxidantes para a detoxificação do peróxido de hidrogê- nio, como também permite a produ- ção de compostos antimicrobianos. É capaz de catalisar reações na presença de peróxido de hidrogeno, de iodo, de bromo e de tiocianato, produzindo assim os compostos de hipotiocianato (OSCN-), hipoidito (OI-) e hipobromito (OBr-). Essa enzima possui um núcleo férrico e não suporta os tratamentos térmicos. Por isso, pode ser usada como indicador de um trata- mento térmico do leite. Sem a presença dos cofatores iodo, tiocianato e bromo, ela detoxifica o peróxido e produz o que se costuma chamar de inibição suícida (se destrói na catálise). Exemplo de reação (detoxificação do peróxido e catálise do tiocianato) :
H2O2 + SCN- → OSCN- + H2O
A maior parte da lactoperoxidase disponível é extraída do leite de vaca ou do soro do leite, onde está presente em grandes quantidades (50 mg/l). As concentrações mais importantes foram observadas no porquinho-da-índia. Também está presente em todas as mucosas. Em particular, pode ser encontrada na saliva, nas lágrimas, no mucus dos pulmões e na mucosa vaginal. O sistema lactoperoxidase (lacto- peroxidase-tiocianato-percarbonato) é reconhecido pelo Codex Alimentarius como sendo uma alternativa à refrigeração do leite porque permite, a 37°C, conservar o leite sem contaminação microbiana. Assim, dependendo das condições climáticas vigentes no país, ativando essa função pode-se transpor- tar o leite em longas distâncias, em temperatura ambiente. A lactoperoxi- dase tem sido objeto de vários estudos visando sua utilização como meio de controlar o desenvolvimento da acidez e mudanças de pH durante a estocagem resfriada de iogurte.A lactoperoxidase também esta sendo estudada quanto à possibilidade de ser utilizada como conservante natural. É usada no tratamento de frutas, como as mangas, por exemplo. Em combina- ção com outros conservantes, a lactoperoxidase é usada como ingrediente em pasta de dente para combater cáries.
Funciona muito bem em sinergia com a lactoferina e lisozima.
ENZIMAS PARA MATURAÇÃO DE QUEIJOS
Como é o caso da maioria das boas idéias científicas, a transferência de tecnologia de processos para a fabricação de produtos exclusivos, muitas vezes, apresenta desafios imprevistos. E assim o foi para aqueles que tentaram colocar enzimas proteolíticas em queijo. A Figura 1 ilustra as etapas da fabricação de queijos de massa dura e semi-dura que podem ter pontos de adição de enzimas para o amadurecimento. Este esquema se aplica a qualquer enzima, mas as implicações do processo são mais graves no caso das proteinases, daí a ênfase.
A adição de proteinase no queijo, para quebrar a caseína, é necessária em quantidades muito pequenas por- que, assim como todas as enzimas, as proteinases são catalisadoras e uma pequena quantidade irá converter uma grande quantidade de substrato. Isso é bom do ponto de vista da eficiência de custos e da conversão, mas significa misturar gramas de enzimas ativas com toneladas de queijo. Colocar uniformemente as enzimas na complexa matriz tridimensional que é o queijo já é, por si só, suficientemente difícil, mas o problema da distribuição das quantidades tão pequenas está longe de ser trivial. A adição de enzimas no leite para fabricação de queijo no ponto a, como mostra a Figura 1, seria logisticamente ideal, pois nesse ponto também adiciona-se a cultura starter e o coalho, sendo tudo cuidadosamente misturado. No entanto, ao contrário dos outros com- ponentes da receita, as proteinases de amadurecimento começam rapidamente a remover os peptídeos solúveis das caseínas.
Esses peptídeos são perdidos no soro de leite quando a coalhada é separada, causando perdas inaceitáveis para a produção de queijo. Além disso, o colapso precoce das caseínas quebra sua estrutura ordenada, evitando a devida formação de gel, e tornando a coalhada macia e impraticável nos estágios posteriores da acidificação da coalhada, antes da salga e prensagem do queijo. Adicionando-se, ainda, a estes problemas a perda de enzimas adiciona- das ao soro de leite (com uma taxa de cerca de 95%), fica claro que a adição de proteinases diretamente no leite não é uma opção. Se as preparações de peptidase fossem extremamente baratas, poderiam ser adicionadas nesse ponto, mas a maioria dos grandes fabricantes de queijo comercializa seu soro como concentrados para serem adicionados a diversos alimentos, devido a sua funcionalidade.
Qualquer carga de enzima de amadurecimento deveria então ser retirada ou destruída, antes do soro de leite ser processado e comercializado. A microencapsulação da enzima é a solução óbvia para o problema acima, para proteger as caseínas do leite e garantir o seu aprisionamento físico na matriz de gel da coalhada. As opções incluem amido, gordura ou cápsulas de gelatina, mas nenhum deles apresenta um mecanismo de liberação satisfatório no caso dos queijos. Os queijos semi-duros Gouda e Edam são fabricados por um processo que inclui uma etapa de “lavagem” da coalhada, no qual a mesma é lavada em água quente, reduzindo a sua acidez e contribuindo para um queijo de sabor mais suave. Embora essa fase (ponto b na Figura 1), e o próprio ponto onde a coalhada é macia (ponto c) oferecem uma nova oportunidade para introduzir uniformemente enzimas na matriz do queijo, ambos criam problemas de amolecimento prematuro da coalhada, redução de produtividade/rendimento e perda de enzimas “não inclusas” na coalhada.
Os queijos de coalhada lavada são salgados por salmoura e não por sal convencional, por isso poderia se pen- sar que o ponto c (veja Figura 1) seria um ótimo ponto de adição de enzimas; contudo, as pesquisas indicam que a penetração das enzimas em salmoura, na textura do queijo prensado, seria muito baixa, descartando assim este caminho, tornando o coalho de queijo lavado muito difícil de ser tratado com enzimas de amadurecimento.Nas variedades de queijo salgados com sal seco, como o Cheddar, a adição de enzimas junto com o sal em coalha- das moídas (ponto d, imediatamente antes da prensagem para formar blocos de queijo) foi originalmente proposta para fabricação de queijos... em escala laboratorial. No entanto, esta técnica é difícil de ser adaptada aos equipamentos automatizados de salga em fábricas com produção de larga escala e, embora as enzimas pudessem ser granuladas e misturadas com o sal seco, trata-se de um processo caro para um ingrediente barato (sal), e por isso não é muito utilizado. Como pôde ser observado, a área que envolve a tecnologia da adição de enzimas necessita de novas idéias.
Por exemplo, há conhecimentos suficientes em enzimologia molecular aplicada para a elaboração de matrizes e materiais de apoio para a criação de micropartículas complexas de enzimas, que possam tanto liberar como metabolizar amino- ácidos, ácidos graxos e açúcares para se obter os conhecidos compostos de sabor e aroma desejados. Tais conhecimentos já existem e são aplicados em outros se- tores, porém, no campo da maturação de queijo ou affinage como falam os técnicos franceses, ainda é a mãe natureza e o tempo que são os grandes atores nesse processo de amadurecimento.
ENZIMA LISOZIMA
A lisozima é uma enzima desco- berta pelo médico escocês descobri- dor da penicilina Alexander Fleming (1881-1955), em 1922. Sua estrutura tridimensional foi definida por David Chilton Phillips (1924-1999), em 1965, quando conseguiu uma imagem com uma resolução de 2 angstrom (200pm). Howard Florey (1898-1968) e Ernst B. Chain (1906-1979) também estudaram as lisozimas; embora não tivessem muito éxito nesse campo, trousseram bastante progresso no desenvolvimento da penicilina, completando o trabalho de Fleming. A lisozima é uma proteína globular formada de resíduos de aminoácidos (129 no ser humano) que pode ser encontrada em algumas secreções (lá- grimas, saliva, leite materno, mucus ...) e na clara de ovo. É também produzida pelas bactérias e por outros organismos. Ela digere certos carboidratos de alto peso molecular; assim as bactérias que contém esses carboidratos na estrutura de sua parede celular desintegram-se ou partem-se sob a ação da lisozima. A lisozima destrói o esqueleto glicosídico do peptideoglicano, ou seja, destrói a camada protetora de muitas bactérias. A sua ação se deve à hidrólise das ligações glicosídicas beta 1,4 entre resíduos do ácido N-acetilmurâmico (Mur2Ac) e N-Acetil-D -glucosamina (GlcNAc) num pepitídeoglicano.
A enzima usa um mecanismo de catálise covalente e catálise ácida geral, promovendo duas reações de deslocamento nucleofílicos sucessivos. Ela se liga a seis resíduos de Mur2Ac e GlcNAc que se alternam num peptídeoglicano típico de bactérias, como o PDP ID 1 LZE. A ligação clivada é aquela entre o 4o e 5o resíduos que foram ligados pela enzima. Existem dois mecanismos propostos para esta reação. O primeiro deles, proposto por Phillips e colegas, leva em consideração um mecanismo SN1, que atualmente não é mais aceito. O mecanismo mais aceito atualmente, proposto por Stephen Withers e colegas, leva em conta um mecanismo SN2. Neste mecanismo, o 4o e 5o resíduos entram no sítio ativo da enzima, e o aminoácido Asp52 da lisozima ataca o carbono ano- mérico do Mur2Ac. Este ataque libera o par de elétrons do carbono da GlcNAc, que se liga a um hidrogênio cedido pelo Glu35. Neste ataque, a ligação é clivada, e a GlcNAc (junto com o resto do peptídeoglicado ligado a ela) agora é liberada da enzima, que ainda está ligada covalentemente ao Mur2Ac. Esta ligação é quebrada com o ataque da água, que cede um -OH ao Mur2Ac e um H ao Glu35, restaurando a enzima e liberando o restante do peptídeoglicano.
As lisozimas comerciais de grau alimentício são oriundas da albumina do ovo. A lisozima é usada pelos fabricantes de queijos como agente de controle de deterioração, defeitos texturais apresentando fissuras e burracos irregulares causados por fermentação butirica em variedades de queijos de massa dura e semi-dura, como Gouda, Grana Padano, Emmental, Gryyère, Danbo e outros. Tradicionalmente, esse defeito, causado por Clostridium tyrobutyricum no leite cru, tem sido controlado pela adição de nitrato de potássio. Mas, essa prática esta sendo eliminada por ser associada a produção de carcinogenos e, por isto, a lisozima tornou-se o agente de controle pre- ferido. O Clostridium tyrobutyricum é um formador de esporos e, como tal, não pode ser eliminado por pasteurização, daí a necessidade de tratar o leite por outros métodos. A lisozima mata as células vegetativas e também elimina o crescimento de esporos em queijo.
Embora a lisozima iniba também as bactériasácido-lácticas usadas como starters no processo de fabricação de queijos, elas são menos sensíveis do que as bactérias Clostridium e uma dose de enzimas de 500 unidades/ml é suficientemente seletiva (as preparações comerciais de lisozima contêm cerca de 20.000 unidades/mg). A lisozima também inibe o crescimento de Listeria monocytogenes em iogurtes e queijos frescos de alta acidez (<pH 5,0), mas o efeito não é suficientemente consistente para se basear nele na produção comercial de produtos à base de leite fermentado e, em todos os casos, uma alta acidez é normalmente suficiente em si para inibir esses patogénos.
ENZIMA LIPASE
Embora as lipases sejam utilizadas na tecnologia de produção de aromas de queijos, são também usadas para fabricar produtos de gordura láctea modificada para outras aplicações alimentícias. A gordura de leite lipolisada possui aroma cremoso, de manteiga e de queijo, derivado dos ácidos graxos de cadeia curta a média e de derivados químicos de ácidos graxos liberados da gordura de leite por lipases. O substrato de matéria-prima para a fabricação de gordura de leite lipolisada é ou leite condensado ou óleo de manteiga emulsiona- do, para maximizar a área superficial da gordura para ativar a lipase. As lipases são adicionados e deixadas em contato com o substrato à temperatura ótima (para as enzimas utilizadas), até o sabor/ aroma requeridos ser alcançado, ou até que um valor pré-determinado de grau de acidez seja atingido, correspondendo a uma liberação mensurável de ácidos graxos pela lipase.
O produto é pasteurizado, liofilizado (ou ajustado de outra forma para um teor de sólidos padrão) e embalado. Os produtos de gordura de leite lipolisada incluem coberturas de chocolate e xaropes, aromas de manteiga para margarina, cremes e molhos artificiais, flavorizantes para branqueadores de café e aditivos saborizantes de queijo. O tipo de lipase utilizada na pro- dução de LMF depende da aplicação alimentícia na qual se pretende usálo. Geralmente, bons produtos LMF para uso em produtos cozidos podem ser fabricados usando preparações à base de lipase pancreática, esterase pré-gástrica de cordeiro e cabrito, e fungos/mofo de lipases de Aspergillus niger, Geotrichum e Penicillium ro- queforti. Algumas lipases bacterianas também são adequadas (Achromobacter lipolyticum e Pseudomonas), mas as LMF para uso em panificação não devem ser preparadas com lipases de Achromo- bacter, Penicillium ou Geotrichum, para evitar sabores ensaboado e mofo/bolor; as esterases pré-gástricas também produzem uma proporção demasiadamente elevada de ácido butírico para fabricação de pão, no qual tendem a produzir notas aromáticas de ranço.
Modificação intra e intermolecular de gordura láctea por lipase catalisada. A interesterificação química, acidólise, alcoólise e transesterificação têm sido usadas por muitos anos para modificar as propriedades físicas/funcionais da gordura do leite, mas recentemente, a tecnologia usando as lipases tem substituído a tecnologia química, propiciando um processamento mais preciso e mais “limpo. Em particular, substitutos de gordura do leite têm sido preparados como substitutos parciais da gordura do leite em alimentos para bebês. No entanto, o fracionamento da gordura por métodos físicos ainda é a opção comercial preferida para a modificação da gordura do leite em aplicações para produtos lácteos.
ENZIMA LACTASE
A lactase em forma de tabletes (por exemplo, Lactaid®), mastigáveis ou não, é comercializada no Brasil como um medicamento in vitro para a intolerância à lactose, uma condição generalizada causada por uma deficiência de lactase no trato digestivo, tendo como sintomas, cólicas abdominais, flatulência e diarréia, devido ao acúmulo de lactose no lúmen intestinal. Os tabletes de lactase da Lactaid® fornecem lactase ativa ao intestino para quebrar a lactose ingerida e aliviar os sintomas da intolerância. O xarope hidrolisado de soro de leite é produzido a partir do soro de leite, subproduto da fabricação de queijos e produção de caseína. A etapa de hidrólise pode ser sobre o soro em si, ou sobre o permeado do processo de ultra filtração (UF), usado para fazer o concentrado protéico de soro.
O permeado da UF ainda contém algumas proteínas do soro, mas é enriquecido com lactose. É concentrado com 15% a 20% de sólidos totais, desmineralizado, normalmente por troca iônica, através de eletrodiálise ou nanofiltração, sendo, então, aquecido em função do tipo de tratamento de lactase a ser utilizado. A etapa de hidrólise pode ser por enzima imobilizada em reator de coluna, utilizando lactase (Aspergillus Oryzae). Os reatores com enzimas imobilizadas podem alcançar 90% de hidrólise de lactose, enquanto que o processo tradicional por lotes (yeast lactase) atinge apenas 70%. No entanto, ambos os processos produzem glicose livre e galactose suficiente para adoçar o produto, sendo essa propriedade alcançada pela evaporação do hidrolisado, a 60% de sólidos totais, para fabricação do xarope final. Um diagrama típico do fluxo desse processo é apresentado na Figura 3.
Culturas Lácteas
O leite é o meio de cultura ideal para o crescimento de diversos tipos de microrganismos. Dentre os mais importantes, destacamos as bactérias. Elas representam uma relação de amor e ódio entre as Indústrias, uma vez que podem ser tanto desejáveis (produção de derivados lácteos), como indesejáveis (patógenos). As bactérias lácteas possuem a capacidade de fermentar a lactose, principal carboidrato do leite, originando quantidades consideráveis de ácido lático e ácido pirúvico. A pasteurização do leite garantiu a inocuidade dos derivados lácteos, mas ao mesmo tempo “esterilizou” a flora natural dele.
Com isso, surgiu a necessidade da utilização de culturas lácteas liofilizadas para a produção dos derivados lácteos, no qual grupo de microrganismos são identificados, selecionados, quantificados, liofilizados e comercializados. Na liofilização, após o produto estar congelado a temperaturas inferiores a 30ºC, ele é submetido a uma pressão negativa (vácuo), fazendo com que a água do produto seja retirada por sublimação, ou seja, passe diretamente do estado sólido para o gasoso. Isso preserva as características físico-químicas e microbiológicas do produto.
Fermentos Lácticos
Fermentos lácticos são culturas puras em proporções definidas de diferentes bactérias lácticas que se multiplicam no leite e no queijo assegurando as funções essenciais.É um ingrediente indispensável na fabricação de queijos e possui três funções básicas:
a) Desenvolvimento de acidez – indispensável na fabricação da grande maioria dos queijos fabricados, onde as bactérias metabolizam a lactose formando moléculas de ácido lático e normalmente ocorre uma parte no tanque de fabricação e outra parte já no queijo enformado (durante a prensagem, salga e no início da maturação).
b) Formação de olhaduras – bactérias consomem o lactato de sódio (sal do ácido lático) produzindo ácido propiônico, ácido acético e CO2. A presença de olhaduras na massa do queijo é uma característica típica de alguns queijos tais como: Reino, Estepe, Suíço, Gouda, etc.
c) Formação de sabor e aroma – é um complexo bioquímico que ocorre durante a maturação do queijo. A caseína, principal proteína do leite é degradada (proteólise) em compostos menores que modificam a estrutura do queijo tornando-a mais macia, solúvel e alterando o sabor do queijo. A gordura também por ação de enzimas lipolíticas (lipólise) vai sendo degradada e conferindo sabor e aroma aos queijos. As enzimas que catalisam estas reações são liberadas pelos microrganismos do fermento lático. De acordo com sua temperatura de crescimento, os fermentos são classificados em:
As culturas mesofílicas são normalmente utilizadas na fabricação de queijos frescos, de massa crua e de massa semicozida. Pode-se ter no produto final um queijo de textura fechada ou com a presença de olhaduras regulares. O sabor do queijo pode ser mais ou menos acentuado, dependendo do tipo de cultura utilizada. As culturas termofílicas são compostas por bactérias que se desenvolvem melhor em meios com temperaturas mais elevadas como, por exemplo, 42 – 45ºC. Seu uso é indicado para os queijos de massa cozida (aqueles cuja temperatura de cozimento da massa chega a 50ºC). Podem-se formar culturas mistas mesofílicas e termofílicas (80% e 20% respectivamente).
As culturas homofermentadoras produzem ácido lático (cerca de 90%) a partir da fermentação da lactose e não produzem gases (indicada para queijos de massa fechada, sem olhaduras e pouco aroma). Já as culturas heterofermentadoras produzem ácido lático a partir da fermentação da lactose e produzem compostos aromáticos (diacetil) e gás carbônico a partir da fermentação do citrato do leite. É indicado para queijos onde se deseja um aroma mais forte e a formação de olhaduras regulares na massa.
Comercialmente, eles são classificados em:
Tipo O
Composição: Lactococcus lactis subsp lactis e Lactococcus lactis subsp cremoris.
Utilização: Minas Padrão, Prato, Mussarela, Saint-Paullin, etc.
Função: acidificação, não produz olhaduras.
Tipo D
Composição: Lactococcus lactis subsp lactis, Lactococcus lactis subsp cremoris e Lactococcus lactis biovar diacetylactis.
Utilização: Queso blanco, manteiga, cottage.
Função: acidificação, aroma e muito gás.
Tipo L
Composição: Lactococcus lactis subsp lactis, Lactococcus lactis subsp cremoris e Leuconostoc cremoris.
Utilização: Buttermilk, Gouda, Edan.
Função: acidificação, aroma, e gás.
Tipo LD
Composição: Lactococcus lactis subsp lactis, Lactococcus lactis subsp cremoris, Leuconostoc cremoris e Lactococcus lactis biovar diacetylactis.
Utilização: Prato, Gouda, Edan, Danbo, Tybo, Manteiga, etc.
Função: acidificação, aroma e olhaduras.
Características básicas de cada cultura láctea
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Lactococcus – são cocos Gram-positivos pertencentes ao grupo das bactérias lácticas. Trata-se de microrganismos que produzem exclusivamente ácido lático. Crescem a 10ºC, com temperatura ótima em torno de 30ºC. Não crescem na presença de 6,5% de NaCl, nem em pH 9,6. São usados amplamente na indústria de laticínios por causa da sua capacidade de produzir ácido lático e aroma, bem como à sua segurança para o consumo humano, visto que são geralmente conhecidos como seguros. Constitui cerca de 90% da população de microrganismos componentes de fermentos empregados na fabricação de manteiga, queijo, buttermilk e sour cream.
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Lactobacillus – apresentam-se na forma de bacilo ou cocobacilo frequentemente organizados em cadeia. São frequentativos, aerotolerantes, mas crescem bem em condições de anaerobiose. Preferem condições relativamente ácidas. Em queijos, as espécies Lb. helveticus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. Delbrueckii subsp. lactis são utilizadas como culturas startes para diversos tipos de queijos, como Emmental, Provolone, Gorgonzola, Mussarela, entre outros.
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Leuconostoc – o gênero inclui 23 espécies. As principais espécies associadas com produtos lácteos são: L. mesenteroides subsp. cremoris e L. latis. Durante a fermentação, produtos do metabolismo primário dos carboidratos, como os ácidos orgânicos, contribuem para a preservação do produto, porém sua principal importância tecnológica diz respeito à formação do aroma e textura, principalmente pela produção de CO2 e síntese de diacetil.
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Streptococcus – trata-se de uma bactéria láctica termofílica com capacidade de fermentar e converter rapidamente a lactose em ácido lático, causando rápida diminuição do pH. Tem sido tradicionalmente utilizado na produção de iogurte e vários tipos de queijos, como Mussarela, Cheddar, Emmental, Gruyère, Parmigiano, entre outros.
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Actinobacteria – a classe inclui vários gêneros com espécies de interesse industrial, principalmente na produção de queijos. A presença de bactérias propiônicas endógenas ou adicionadas ao leite na forma de fermento é indispensável para conferir as características essenciais de sabor e textura de vários queijos de massa cozida, como Gruyère e Emmental.
Culturas Propiônicas
Podem ser encontradas naturalmente no leite, em alguns casos sendo indesejáveis por suas características, podendo resistir ao tratamento térmico do leite. A principal espécie é o Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii e Propionibacterium freudenreichii subsp globosum. São Gram +, preferem anaerobiose, não formam esporos, são sensíveis ao pH baixo, sal e nitratos. A temperatura ótima de crescimento é 30ºC. Por meio da fermentação do lactato, produzem ácido propiônico, ácido acético, e CO2. O ácido propiônico junto com os aminoácidos propina e hidroxiprolina auxiliam na formação do gosto adocicado do Emmental. Utilizado em queijos com olhaduras como: Gouda brasileiro, Emmental, Prato Esférico, Gruyère.
Mofos e Leveduras
Os mofos e leveduras também são microrganismos muito importantes na fabricação de derivados lácteos. Eles podem se desenvolver em queijos naturalmente (maturação de queijos em cavernas francesas), como podem ser intencionalmente adicionados ao leite.
Os mais conhecidos e utilizados nas indústrias, são:
Penicillium glaucum (ou roqueforti)
De crescimento rápido, possui elevados índices de proteólise e lipólises. Usado em queijos azuis (Roquefort, Gorgonzola, Stilton, Danablu, Blue, etc.). No mercado há várias cepas, com capacidades lipolítica e proteolítica diferentes e podem ser adicionado ao leite ou à massa. Resiste até 13% de sal na umidade. É aeróbio e cresce bem em pH de 4,6 a 4,8.
Considerava-se que o papel das leveduras na fabricação de queijos era apenas danoso, porém, recentemente tem sido considerado mais positivo. O uso de leveduras é interessante para a neutralização da massa através do consumo de ácido lático e lactato como fonte de carbono. São uma importante fonte de enzimas, o que lhes confere papel coadjuvante preponderante na produção de substâncias destinadas a melhorar o crescimento de outros microrganismos. As leveduras podem ser usadas em: Queijos de casca lavada, como Reblochon, Tallegio, Munster e Limburgo como microflora superficial.
Penicillium candidum - Camembert
Crescimento rápido, dificultando o desenvolvimento de contaminantes como leveduras, outros mofos e bactérias. Cor muito branca, micelium curto e índices de proteólise e lipólise médios garantindo harmonia entre sabor e aroma. Mofo branco com aspecto aveludado. Usado em Camembert, Brie e queijos de leite de cabra. Crescem bem em pH de 4,7 a 4,8. Se desenvolve em até 10% de sal na umidade. Pode ser adicionado ao leite, pulverizado na superfície do queijo ou colocado na salmoura.
Geotrichum candidum
Cultura complementar. Seu crescimento modifica o meio favorecendo e controlando o desenvolvimento do Penicillium candidum. Propicia a formação de sabor e aroma distintos, contribui para evitar a formação de sabor amargo e previne o crescimento de mofos, leveduras e bactérias indesejáveis. Utilizado em queijos de mofo branco e de casca lavada como: Camembert, Brie e Pont l’Éveque, Reblochon.